产品介绍：

pcDNA3.1(+)是源自pcDNA3的5.4kb载体，专为在哺乳动物宿主中高水平稳定和瞬时表达而设计。在大多数哺乳动物细胞中可以进行高水平的稳定和非复制性瞬时表达。载体包含以下元件：人巨细胞病毒即刻早期（CMV）启动子在多种哺乳动物细胞中高水平表达；用于筛选稳定细胞系的新霉素抗性基因等。

基因克隆方法应用广泛的有酶切连接克隆和无缝克隆，酶切连接克隆的载体制备对于新手来说比较麻烦，需要准备载体以及PCR产物还需要进行酶切和回收等多个步骤。无缝克隆只要准备好载体，PCR产物回收后可以直接用于连接，大大缩短试验时间。

使用方法：

1、本产品是将pcDNA3.1（+）载体用BamHI和XhoI双酶切后，回收的线性化载体。

2、无缝克隆引物设计方法，当做克隆载体使用，可以在扩增PCR产物的：

（1）上游引物5’端添加序列：TTAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCACCATG。（其中划线部分为载体上的序列，CCACCATG为KOZAK序列，ATG为翻译起始位置，注意不要移码。）

（2）下游引物5’端添加序列：TAAACGGGCCCTCTAGACTCGAGTCA。（其中划线部分为载体上的反向序列，TCA为终止密码子）。

3、测序引物

（1）上游引物T7：TAATACGACTCACTATAGG

（2）下游引物BGH：TAGAAGGCACAGTCGAGG

产品介绍：
pET-32a(+)载体是原核表达载体，用于表达可溶性、具有活性功能的蛋白；具有N端Thrombin（凝血酶）酶切位点，N端肠激酶酶切位点，带氨苄抗性。
基因克隆方法应用广泛的有酶切连接克隆和无缝克隆，酶切连接克隆的载体制备对于新手来说比较麻烦，需要准备载体以及PCR产物还需要进行酶切和回收等多个步骤。无缝克隆只要准备好载体，PCR产物回收后可以直接用于连接，大大缩短试验时间。

使用方法：

1、本产品是将pET-32a(+)载体用BamHI和XhoI双酶切后，回收的线性化载体。

2、无缝克隆引物设计方法，当做克隆载体使用，可以在扩增PCR产物的：

（1）上游引物5’端添加序列：GACAAGGCCATGGCTGATATCGGATCC。

（2）下游引物5’端添加序列：CAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAG。

3、测序引物：

（1）上游引物T7：TAATACGACTCACTATAGGG。

（2）下游引物T7-ter：TGCTAGTTATTGCTCAGCGG。

产品介绍：
pET-28a(+)载体是原核表达载体，带卡那抗性。
基因克隆方法应用广泛的有酶切连接克隆和无缝克隆，酶切连接克隆的载体制备对于新手来说比较麻烦，需要准备载体以及PCR产物还需要进行酶切和回收等多个步骤。无缝克隆只要准备好载体，PCR产物回收后可以直接用于连接，大大缩短试验时间。

使用方法：

1、本产品是将pET-28a(+)载体用NcoI和XhoI双酶切后，回收的线性化载体。

2、无缝克隆引物设计方法，当做克隆载体使用，可以在扩增PCR产物的：

（1）上游引物5’端添加序列：TAACTTTAAGAAGGAGATATACC。

（2）下游引物5’端添加序列：TCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAG。

3、测序引物：

（1）上游引物T7：TAATACGACTCACTATAGGG。

（2）下游引物T7-ter：TGCTAGTTATTGCTCAGCGG。

 产品介绍：
pDC316-ZsGreen1-shRNA体是Admax腺病毒穿梭载体，用于RNA干扰，该载体带绿色荧光蛋白ZsGreen1基因，和pBHGlox_E1,3Cre骨架载体一起包装重组腺病毒用。
基因克隆方法应用广泛的有酶切连接克隆和无缝克隆，酶切连接克隆的载体制备对于新手来说比较麻烦，需要准备载体以及PCR产物还需要进行酶切和回收等多个步骤。无缝克隆只要准备好载体，PCR产物回收后可以直接用于连接，大大缩短试验时间。

使用方法：

1、本产品是将pDC316-ZsGreen1-shRNA载体用PstI和BamHI双酶切后，回收的线性化载体。

2、无缝克隆引物设计方法，当做克隆载体使用，可以在扩增PCR产物的：

（1）上游引物5’端添加序列：CTTGTGGAAAGGACGAAACACCTGCAG。

（2）下游引物5’端添加序列：TCGAAGTCGAGGTCGACATTGGGATCC。

3、测序引物M13R：CAGGAAACAGCTATGAC。

产品介绍：

pDC316载体是Admax腺病毒穿梭载体，该载体不带绿色荧光蛋白基因，和pBHGlox_E1,3Cre骨架载体一起包装重组腺病毒用。

基因克隆方法应用广泛的有酶切连接克隆和无缝克隆，酶切连接克隆的载体制备对于新手来说比较麻烦，需要准备载体以及PCR产物还需要进行酶切和回收等多个步骤。无缝克隆只要准备好载体，PCR产物回收后可以直接用于连接，大大缩短试验时间。

使用方法：

1、本产品是将pDC316载体用EcoRI和HindIII双酶切后，回收的线性化载体。

2、无缝克隆引物设计方法，当做克隆载体使用，可以在扩增PCR产物的：

（1）上游引物5’端添加序列：ACCACCGTAGAACGCAGATCGAATTCCACCATG。（其中划线部分为载体上的序列，CCACCATG为KOZAK序列，ATG为翻译起始位置，注意不要移码。）

（2）下游引物5’端添加序列：TGCTCGAAGTCGACGAGCTCAAGCTTCA。（其中划线部分为载体上的反向序列，TCA为终止密码子）。

3、测序引物

（1）上游引物pDC316F：ACGTGGGTATAAGAGGCG

（2）下游引物M13R：CAGGAAACAGCTATGAC

产品介绍：

pDC316-mCMV-EGFP载体是Admax腺病毒穿梭载体，该载体带绿色荧光蛋白基因，和pBHGlox_E1,3Cre骨架载体一起包装重组腺病毒用。

基因克隆方法应用广泛的有酶切连接克隆和无缝克隆，酶切连接克隆的载体制备对于新手来说比较麻烦，需要准备载体以及PCR产物还需要进行酶切和回收等多个步骤。无缝克隆只要准备好载体，PCR产物回收后可以直接用于连接，大大缩短试验时间。

使用方法：

1、本产品是将pDC316-mCMV-EGFP载体用NheI和HindIII双酶切后，回收的线性化载体。

2、无缝克隆引物设计方法，当做克隆载体使用，可以在扩增PCR产物的：

（1）上游引物5’端添加序列：CTATAGGGAGACCCAAGCTGGCTAGCCACCATG。（其中划线部分为载体上的序列，CCACCATG为KOZAK序列，ATG为翻译起始位置，注意不要移码。）

（2）下游引物5’端添加序列：CTGATCAGCGGTTTAAACTTAAGCTTCA。（其中划线部分为载体上的反向序列，TCA为终止密码子）。

3、测序引物

（1）上游引物T7：TAATACGACTCACTATAGG

（2）下游引物BGH：TAGAAGGCACAGTCGAGG

①拥有目前最强，调控机理最严格的启动子之一醇氧化酶基因AOX1启动子，非常利于外源基因的表达调控；

②具有翻译后的蛋白加工修饰功能例如磷酸化、糖基化等，是一种不可多得的集聚多种优势的真核表达系统；

③ 既可以在细胞内表达，也可在细胞外表达；

④培养基成本低廉，培养条件简单，生长繁殖速度迅速；

⑤外源基因可以单拷贝或者多拷贝的形式在特定的位点整合进酵母染色体上，伴随着染色体的复制而复制，有较高的遗传稳定性，同酿酒酵母一样以稳定的表达菌株存在；

⑥可以进行大规模发酵，适合高密度培养，非常适合重组真核蛋白的工业放大化生产制备。

毕赤酵母宿主菌常用的菌株类型有四种，分别是X33、GS115、KM71H、SMD1163/8。其中X33是野生型菌株，而GS115和KM71H两种，都具有His4营养缺陷标记。GS115 菌株具有AOX1基因，属于Mut⁺，指的是甲醇利用正常型；KM71 H菌株的AOX1位点被ARG4基因插入，属于Mut^s，指甲醇利用缓慢型，两种菌株都适用于一般的酵母转化方法。SMD116（his4 pep4）属于蛋白酶缺失型菌株，它能够表达一些由于蛋白降解而引起的的表达产物分布不均的问题。只是由于SMD116（his4 pep4）菌株生长缓慢，导致表达的外源蛋白质产量低。

服务内容：
1、亚克隆：亚克隆至两个适当的表达载体中，制备大量质粒，构建线性化载体。
2、表达条件优化及评估：将线性载体转化至适合的寄主菌株中，通过PCR方法确定阳性转化株，表达条件优化及确认–确定培养基及诱导浓度，SDS-PAGE以及Western blot分析。
3、蛋白表达及纯化：少量表达，纯度达90%以上。
服务价格及周期：

载体选择：

服务承诺：
1、基因合成和载体构建参见相关服务部分。
2、本公司会在最短的时间内快速完成实验，并为客户提供足量蛋白以满足科研需求。
3、提供完整的实验报告。
4、提供合乎客户要求量和纯度的特定蛋白。

慢病毒服务简介:

慢病毒载体可以将外源基因或外源的shRNA有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达目的序列的效果。在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的的基因治疗效果。对于一些较难转染的细胞， 如原代细胞、干细胞、不分化的细胞等，使用慢病毒载体，能大大提高目的基因或目的shRNA的转导效率，且目的基因或目的shRNA整合到宿主细胞基因组的儿率大大增加，能够比较方便快捷地实现目的基因或目的shRNA的长期、稳定表达。

慢病毒(Lentivirus) 载体是以HIV-1 (人类免疫缺陷Ⅰ型病毒)为基础发展起来的基因治疗载体。区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。所以，在体外实验及体内实验的研究中，慢病毒己经成为表达外源基因或外源shRNA的常用载体形式之一， 并且正在获得越来越广泛的应用。

服务价格及周期:

备注：以上价格仅仅是病毒包装的价格，不包含基因和载体构建的费用。

慢病毒对照价格及周期:

慢病毒包装系统组成:

慢病毒包装系统一般由慢病毒表达载体和慢病毒包装载体组成。慢病毒表达载体，即通常所说的穿梭载体，包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。而慢病毒包装质粒可提供所有的转录并包装RNA到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋白。为产生高滴度的病毒颗粒，需要利用表达载体和包装质粒同时共转染细胞，在细胞中进行病毒的包装， 包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中，离心取得上清液后，可以直接用于宿主细胞的感染。现在的慢病毒包装系统一般都是三质粒或四质粒包装系统。其中四质粒系统比三质粒系统在生物安全性上更好一些，所以应用较多。

慢病毒包装系统载体选择:

目前市面上常见的商业化慢病毒包装系统较多，其中常用的有Clontech 、Invitrogen 等公司的相关产品。本公司通过大量实验摸索，博采众家之长，建立起了一套稳定、可靠、高效的慢病毒包装系统。这套慢病毒包装系统， 其穿梭载体主要来自Clontech公司，包括以下载体：

转染了红色荧光蛋白载体或绿色荧光蛋白载体24小时后的病毒包装293-t细胞荧光显微镜观察结果：

您可以根据需要，选用合适的穿梭载体来装载目的基因或者目的shRNA。在实际使用过程中，我们采用Clontech配套的慢病毒包装质粒pSPAX2和pMD2.G(或Invitrogen公司的pLPl 、pLP2 、pLP/VSVG质粒）。

客户须知:

1. 上述价格均不包括运输费用。如果您需要干冰运输，按照30元/公斤干冰计算，一般需要加10公斤干冰，即干冰运输费用在300元左右。如果采用超低温冰袋运输，则运输费用由AXYBIO公司承担。我们将采用顺丰快递寄送，全国大部分城市隔天到货。
2. 如客户所需包装的目的基因由客户提供，则客户应提供所要构建慢病毒的目的基因的序列及其它相关说明信息（例如装载载体、质粒图谱、酶切位点等）。客户应对所提供的材料及信息负责，如因客户提供的材料及信息不准确而引起的实验延误或经济损失由客户承担。
3. 如客户订购基因过表达的慢病毒，我们承诺交付的慢病毒的滴度不低于10⁷TU/ml，如果低于此滴度，我们将免费重新提供。如果重新提供的病毒还是达不到要求，我们将做退单处理，客户不需支付任何费用。我们会尽量提供高滴度的慢病毒产品，但考虑到慢病毒包装对外源表达框的限制，外源表达框较大时，病毒滴度会受到较大影响，因此，如病毒出毒实际滴度介于10⁷TU/ml和10⁸TU/ml之间，我们将按实际滴度出货。表达shRNA的慢病毒，出毒滴度一般都可以达到10⁸TU/ml。
4. 如果shRNA序列由客户提供，则本公司只负责证明包含有该shRNA序列的慢病毒构建成功，而不对其干扰效率做任何保证。
5. 如客户需委托本公司使用包装好的慢病毒感染目的细胞，建立稳定表达目的基因或目的shRNA的细胞系，则相关实验费用另外计算。

附：慢病毒包装和滴度测定流程

1 表达基因用慢病毒包装载体准备:

2 表达shRNA 用慢病毒包装载体准备:

3 质粒准备和转染

将3或4种质粒混合于15 ml灭菌管中，采用Opti-MEM和Lipo2000进行转染，转染方法参考Lipo2000标准PROTOCOL和本公司的实际经验。

4 收集第一轮的培养基上清

（1）转染后的细胞CO₂培养箱48 h，37℃，收集上清。
（2）收集的上清，4℃ 8000g离心10 min，除去细胞碎片，0.45 μm PVDF膜过滤。
（3）所得病毒液一部分用于测定病毒滴度，其余可冻存于-80℃。
（4）加入10ml新鲜的DMEM+2%NBS培养基。

5 收集第二轮的培养基上清

（1）加入新鲜培养基后，培养24小时。
（2）收集的上清，4℃ 8000g离心10 min，除去细胞碎片，0.45 μm PVDF膜过滤。
（3）所得病毒液一部分用于测定病毒滴度，其余可冻存于-80℃。

6 病毒的浓缩：离心方法采用差速离心法

（1）病毒上清经0.45 μm滤膜处理，于4℃ 10,000g离心15 min。
（2）上清转移至另一干净离心管中，滤液在4℃，40,000g离心2 h。
（3）离心管置于冰浴条件下，用1%体积的DMEM+10% NBS重悬沉淀，重悬时使用同一吸管以避免损失，约每15 s吹打1次，避免产生气泡。

7 测定病毒滴度（荧光显微镜计数）

（1）滴度测定前，以0.5×10⁵浓度种细胞293T于24孔板，每孔1 ml细胞培养基，过夜（12 h）培养使细胞在板底部形成单层，此时细胞密度大约为1.0×10⁵。
（2）取10 μl病毒液+90 μl培养基，依次稀释得到10^-1至10^-8病毒稀释液。24孔板依次加入梯度稀释的待测病毒样品20 μl，留一孔作为对照不加病毒，培养2天。
（3）荧光计数：荧光显微镜下计数带有荧光的细胞数目
（4）计算病毒滴度：荧光细胞数目×稀释倍数（10、10²…10⁸）/接种病毒

目前用芽孢杆菌系统成功表达的真核基因产物有白介素-3(IL-3)、乙肝核心抗原、乙肝PreS2抗原、丙肝病毒壳蛋白、HIV p4Ispf-1蛋白等；成功表达的原核基因产物有甘油-3-磷酸脱氢酶、甘油激酶、纤维素酶、色氨酸合成酶等。

本公司可以根据客户需求进行载体改造和宿主菌改造，或者采用商业化的载体（pHT43载体，配套菌WB800或WB800N)，可以提供胞内或胞外、组成型或诱导型的表达；可以提供GST、His、HA，Flag、myc、MBP等标签。

服务内容：
1、亚克隆：亚克隆至两个适当的表达载体中，制备大量质粒，构建线性化载体。
2、表达条件优化及评估：将线性载体转化至适合的寄主菌株中，通过PCR方法确定阳性转化株，表达条件优化及确认——确定培养基及诱导浓度，SDS-PAGE以及Western blot分析。
3、蛋白表达及纯化：少量表达，纯度达90%以上。
服务价格及周期：

载体选择：

服务承诺：
1、基因合成和载体构建参见相关服务部分。
2、本公司会在最短的时间内快速完成实验，并为客户提供足量蛋白以满足科研需求。
3、提供完整的实验报告。
4、提供合乎客户要求量和纯度的特定蛋白。